Типы ПЦР

Полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction), общепринятые аббревиатуры – PCR, ПЦР. Относится к молекулярно-биологическим аналитическим методам.

проведение ПЦР исследований

Позволяет воспроизвести многократно кусочек ДНК из исследуемого образца, тем самым увеличивая его концентрацию в миллионы раз. За разработку метода ПЦР Кэри Мюллису была присуждена Нобелевская премия в 1993 году.

Применение

Относительно использования в медицине данный метод обеспечил возможность диагностики самых различных заболеваний и состояний.

Проводится ПЦР на:

  • туберкулез
  • ИППП
  • генетические отклонения
  • опухолевые заболевания
  • герпес (6 типа, вызывающий такое распространенное в детском возрасте заболевание, как розеола, анализ на ВПГ 1 и 2 типа)
  • гепатиты (анализ ПЦР качественный/количественный на гепатит С (ц), В (б))
  • папилломавирусную инфекцию (анализ ПЦР на онкогенные типы ‑ ВПЧ 16 и 18 типа) и др.

В иммунологических исследованиях часто используется ПЦР-рестрикционный анализ продуктов амплификации (PCR RFLP). Представляет собой комбинацию двух соответствующих методик. Это разрезание ДНК эндонуклеазами и последующий анализ кусочков методом ПЦР.

исследование фрагментов ДНК

Существуют определенные показания к проведению ПЦР для диагностики инфекционных патологий, в том числе и ИППП:

  • для вирусов герпеса 1 и 2 типа, возбудителей генитального герпеса, метод оказался самым точным и достоверным из существующих лабораторных исследований
  • в отношении папилломавирусов человека метод находит применение с целью идентификации отдельных типов (типирование папилломавирусов) из групп высокого онкогенного риска (16, 18 типа и др.) – причины рака шейки матки, низкого онкогенного риска (6, 11 типов) – возбудителей остроконечных кондилом
  • при бактериальном вагинозе метод является основным для выявления маркеров заболевания (гарднерелл, мобилункуса и др.) и определения состава влагалищной микрофлоры, необходимых для подбора эффективной терапии
  • ПЦР позволяет определять цитомегаловирус в любых биологических тканях
  • в России метод широко используется для диагностики гонореи
  • метод показан для выявления хламидий у беременных при первичном посещении врача и еще раз в третьем триместре
  • метод важен при необходимости выявления кандидоза, вызванного грибками Candida nonalbicans, которые, в отличие от Candida albicans, характеризуются устойчивостью к распространенным антимикотическим препаратам и пр.

Также ПЦР используется в криминалистике, судебной медицине, генной инженерии, антропологии, палеонтологии, сельском хозяйстве, ветеринарии и т.д.

Записаться на прием к специалистам

Принцип работы

Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (собственно ДНК) состоит из двух связанных между собой цепочек из нуклеотидных звеньев.

строение молекулы ДНК

При этом «голова» одной цепочки связана с «хвостом» другой. Водородные связи образуются между строго определенными азотистыми основаниями. В них различные для разных нуклеотидов части. Так, например, гуанин из одной цепочки может связываться только с цитозином другой и т.д. Вот почему, если в наличии имеется одна цепочка ДНК, то следуя правилам взаимодействия можно воспроизвести вторую цепочку. Такая особенность построения ДНК и стала сутью обсуждаемого метода.

Для реализации исследования требуются:

  • анализируемая ДНК или ее кусочек, который станет матрицей для копирования своей части
  • праймеры – созданные синтетически в лаборатории небольшие нуклеотидные последовательности, которые соответствуют по принципу взаимодействия нужным зонам анализируемой ДНК
  • нуклеотиды – «строительный материал»
  • ДНК-полимераза – выделенный из бактерий или архей (своеобразных одноклеточных безъядерных организмов) фермент, который запускает реакцию синтеза от одного конца праймера
  • буфер – раствор, который обеспечивает поддержание необходимой для работы фермента кислотности среды, а также содержит вещества, препятствующие прилипанию реагентов к стенкам реакционного сосуда и предотвращающие нежелательные побочные взаимодействия.

Все смешивают в дистиллированной воде и помещают в амплификатор. Это специальное устройство, в котором реализуется периодические нагрев/охлаждение реакционной смеси с высокой точностью и за считанные секунды.

ПЦР исследование

Обычно требуется синтез кусочков ДНК из 2000-3000 нуклеотидных пар, что достигается за два-три десятка трехэтапных циклов.

Циклы:

  1. Денатурация – разрушение водородных связей путем нагрева и разъединение в результате двух цепочек ДНК.
  2. Отжиг праймеров – присоединение праймеров к освободившимся молекулам ДНК с разных сторон кусочка, который требуется скопировать. Реакция проводится при строго заданной температуре, чтобы данные праймеры взаимодействовали только с нужными зонами. Разработку праймеров проводят с предварительным расчетом с помощью компьютерных программ с учетом всех требований.
  3. Синтез ДНК – собственно построение ДНК-цепи полимеразой из нуклеотидных «кирпичиков». Сначала фермент «крепится» к комплексу матрица-праймер, а затем подбирает необходимый нуклеотид из раствора согласно принципу взаимодействия. Скорость реакции ‑ примерно 3000 нуклеотидов в минуту. Полученная новая молекула служит еще одной матрицей и проходит вместе с «родительской» весь цикл. В результате, количество продукта увеличивается все быстрее и быстрее.

После завершения синтеза на специальном геле с окрашиванием проводят элетрофорез реакционной смеси. Цель – пространственное разделение молекул ДНК, которые становятся заметны визуально (или под УФ-светом). Данный метод позволяет установить, есть ли определенная последовательность нуклеотидных звеньев в исследуемой ДНК. Называется «качественный метод ПЦР».

Другие разновидности ПЦР

Если в роли матрицы исследуемой выступает РНК (например, при изучении РНК вирусов), используется ПЦР с обратной транскрипцией (RT PCR, который важно отличать от такой разновидности, как метод real-time PCR). В данном варианте используется обратная транскриптаза. Это фермент, который по имеющейся РНК выстраивает соответствующую ей ДНК, после чего проводится обычная ПЦР. Для установления в исследуемом материале числа молекул ДНК применяется количественная ПЦР.

диагностика ПЦР количественного типа

Которая и называется real-time PCR, ПЦР «в реальном времени». В этой технике также возможно использование РНК.

В чем заключается главное отличие качественного и количественного методов ПЦР? В последнем случае после каждого цикла проводится замер количества воспроизведенной молекулы флюоресцентными методами. В практической медицине то, какой метод ПЦР качественный или количественный для анализа на инфекции необходим, определяет врач. На основании предполагаемого диагноза и цели исследования (например, для контроля эффективности лечения). В таком режиме часто проводится ПЦР на гепатит С или В. Причем при качественном определении расшифровка результатов не представляет сложности для неспециалиста. Положительный результат - «обнаружено», т.е. выявлен фрагмент ДНК вируса, отрицательный – «не обнаружено». Расшифровать количественный анализ ПЦР на гепатит С можно, воспользовавшись референсными значениями лаборатории, проводившей исследование. Результат «не обнаружено» указывается, если вирусная ДНК вообще не выявлена. Или ее количество меньше предела чувствительности (15-20 МЕ/мл).

  • «Меньше 10 во 2-й степени МЕ/мл» –положительный результат с соответствующим содержанием вируса.
  • «От 10 во 2-й степени до 10 в 8-й степени МЕ/мл» – положительный результат с содержанием вирусных частиц в указанных пределах.
  • «Более 10 в 8-й степени» ‑ концентрация превышает указанное число.

Результат выше верхнего предела измеряемого диапазона, не определяется с достаточной точностью. Различные варианты ПЦР могут использоваться для исследования не ДНК/РНК, а гормонов, токсинов, антител и иных молекул. Принцип такой иммуно-ПЦР ‑ присоединение к выявляемым молекулам (антигенам) ДНК-меченных антител. С последующим копированием ДНК-частей и определением типа и количества анализируемых молекул. Метод позволяет обнаружить инфекционные антигены на самых ранних стадиях болезни.

диагностика инфекций методом ПЦР

Способы осуществления ПЦР

На сегодняшний день существует несколько десятков методик для реализации ПЦР:

  • с горячим стартом – в реакционную среду вносят полимеразу в комплексном соединении с антителами, ингибирующими ее деятельность (поэтому фермент «высвобождается» только в заданный момент реакции);
  • ступенчатая – первые несколько циклов реализуют при более высоких температурах праймерного отжига для увеличения специфичности связывания последних с матричной ДНК, а после накопления некоторого количества новых ДНК-молекул температуру снижают до оптимальной;

суть полимеразной цепной реакции

  • мультиплексная – для выявления сразу нескольких последовательностей используют набор различных праймеров
  • метод RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA – анализ ПЦР случайных полиморфных фрагментов ДНК) – позволяет различить сходные по структуре молекулы, например, дифференцировать виды бактерий, за счет использования очень небольшого праймера (не более 10 нуклеотидов)
  • асимметричная – применяют при необходимости скопировать только одну цепочку анализируемой ДНК, для чего один из праймеров берется в заметном избытке
  • вложенная – используют для снижения количества побочных продуктов за счет добавления двух праймерных наборов и проведения двух реакций последовательно (сначала с праймером для копирования длинного фрагмента, затем – короткого)
  • инвертированная – к методу прибегают, когда последовательность некоторого участка цепи известна, но копирование требуется для другого участка, для чего проводят
    • «разрезание» ДНК рестриктазой
    • «закольцовывание» фрагмента лигазой, так что известные участки оказываются на концах неизвестного
    • проведение стандартной ПЦР
  • цифровая капельная – более точная, чем вариант «в реальном времени», основана на разделении пробы на множество маленьких капель и реализации полимеризации в каждой из них
  • виртуальная – представляет собой аналитический подход для теоретической ПЦР, позволяет оптимизировать подбор праймеров, предсказывать результат копирования и т.д.
  • многое другое.

ПЦР цифрового капельного типа

Таким образом, на сегодняшний день метод является самым мощным вариантом лабораторного исследования.

Его неоспоримые плюсы:

  • высочайшая точность и специфичность
  • совместимость с иными техниками
  • высокая пластичность – возможность решать самые разнообразные задачи
  • постоянное совершенствование, появление новых разновидностей и типов.

Важно понимать, что метод высокочувствителен к минимальным количествам ДНК. Поэтому необходимо очень тщательно соблюдать правила сбора биологического материала. Исключается даже малейшая вероятность загрязнения (со стороны окружающей среды, рук персонала и т.д.).

Поставьте оценку статье: 
Голосов пока нет